1、单分子DNA从纳米孔通过；

　　2、纳米孔上的酶对于测序分子在单核苷酸精度的控制；

　　3、单核苷酸的测序精度控制。目前市场上广泛接受的纳米孔测序平台是Oxford Nanopore Technologies（ONT）公司的MinION纳米孔测序仪。它的特点是单分子测序，测序读长长（超过150kb），测序速度快，测序数据实时监控，机器方便携带等。这篇综述重点总结了MinION测序仪的技术特点和应用领域。

　　一、 MinION测序技术简介MinION纳米孔测序仪的核心是一个有2，048个纳米孔，分成512组，由专用集成电路控制的flow cell。测序原理见图1a所示：首先，将双分子DNA连接lead adaptor（蓝色），hairpin adaptor（红色）和trailing adaptor（棕色）；测序开始，lead adaptor带领测序分子进入由酶控制的纳米孔，lead adaptor后是template read（即待测序的DNA分子）通过纳米孔，hairpin adaptor的作用是DNA双链测序的保证，然后complement read（待测序分子的互补链）通过纳米孔，最后是trailing adaptor通过。

　　在上述测序方法中，template read和complement read依次通过纳米孔，利用pairwise alignment，它们组合成2D read；而在另外一种测序方法中，不使用hairpin adaptor，只测序template read，最终形成1D read。后一种测序方法通量更高，但是测序准确性低于2D read。每个接头序列（adaptor）通过纳米孔引起的电流变化不同（图1c），这种差别可以用来做碱基识别。

 

　　二、 MinION相对于其他NGS测序平台的优势

　　1、碱基修饰的检测纳米孔测序技术可以检测四种胞嘧啶（cytosine）碱基修饰，分别为5－methycytosine，5－hydroxymethycytosine，5－formylcytosine和5－carboxylcytosine。检测准确率为92％－98％。

　　2、实时测序监控对于临床实践，实时获取和分析DNA／RNA序列是一件很重要的事情。对于传统的NGS测序，做到这一点非常不易。但对于MinION，实现起来相对容易。这不仅是因为MinION体积小，易操作等，更是因为在测序过程中单分子穿过纳米孔，其电流变化可以检测并识别，这种设计允许用户在测序过程中根据实时结果做出一些判断。实时测序监控对于MinION针对特定目标序列测序有重要的应用（图2）：当DNA片段通过纳米孔时，如果电流变化呈现与目标序列一样的趋势，则通过纳米孔。如果DNA片段与目标序列呈现不同的电流变化趋势，则不能通过纳米孔。通过这样的方式，实现目标序列的富集，从而显著减少测序时间，对于在野外和即时诊疗有重要意义。

　　3、测得更长的read用MinION测序仪，对于1D read可以获得300kb长的read；对于2D read可以获得60kb长的read。利用MinION测序仪产生的长read，研究人员设法填充了人参考基因组Xq24号染色体一个长50kb的gap。该区域存在多个CT47基因串联拷贝，研究人员利用MinION的长read判断该区域极有可能存在8个CT47基因拷贝。

　　4、结构变异的检测NGS短序列的特征使结构变异的检测往往不准确。这个问题在癌症的检测中尤其严重，这是因为癌症组织中充斥各种结构变异。研究人员发现利用MinION测得的几百个拷贝的长read得到的结构变异结果比NGS平台测得的上百万read得到的结果更可靠。

　　5、RNA表达分析对于RNA表达分析，NGS平台测得的短序列带来的问题是序列需要进行拼接，才能得到转录本。这给可变剪切研究带来困扰。因为通常情况下NGS测序不能产生足够的信息将不同形式的可变剪切区分开来。而利用MinION测序仪产生的长read，可以更好地解决这个问题。研究人员利用果蝇的Dscam1基因为例，其存在18，612种可变剪切形式，利用MinION测序仪可以检测到超过7，000种可变剪切形式，而这样的结果利用NGS的短序列测序是不能够获得的。

　　6、生物信息学配套软件的发展近些年来，随着生物信息分析方法的发展，MinION测序reads成功比对参考基因组的比例已经从66％提升至92％。文章下面对各种工具的适用场景进行了分别介绍。

　　1、碱基识别工具Metrichor是ONT公司推出的基于隐马尔可夫模型进行碱基识别的软件。它的使用需要网络连接。MinION注册用户需要获得开发者账号才能获得软件的源代码。2016年初，两个实验室分别开发了Nanocall和DeepNano软件。这两个软件都可以在本地运行，不需要网络连接。Nanocall基于隐马尔可夫模型，可对1D read在本地进行碱基识别；DeepNano基于recurrent neural network framework，可以获得比隐马尔可夫模型更准确的碱基识别。

　　2、序列比对工具传统的NGS序列比对软件不能满足MinION序列比对的需求。这是因为MinION测序数据错误率相对高且序列长，即使调整参数也不能取得好的效果。在这种情况下，适合MinION测序数据的比对软件应运而生。

　　MarginAlign是通过更好地估计MinION测序reads测序错误来源从而提高与参考基因组的比对效率。通过评估检测到的变异，发现其显著提高了比对的准确性。由于MarginAlign是基于LAST或BWA mem的比对结果进行优化，结果的最终准确性依赖最初的比对结果。GraphMap是另一个用于MinION测序数据比对的软件。它利用的是一种启发式（heuristics）方法，对高错误率reads和长reads进行了优化。一项研究表明GraphMap比对的灵敏性可与BLAST媲美，且它对reads测序错误率的估计与MarginAlign相当。

　　3、从头组装工具MinION测序数据不适合利用NGS数据组装的de Bruijn图法进行组装，主要存在两方面的原因。

　　一是de Bruijn图法等方法依赖测序reads拆分的k－mer测序准确，而高错误率的MinION测序reads不能保证这一点；

　　二是de Bruijn图的结构不适用长reads。MinION测序数据的长reads更适合Sanger测序时期基于有overlap的共有（consensus）序列组装的方法。需要的是在组装前进行测序reads的纠错。第一个基于这种原理进行组装的研究组利用MinION数据组装了一个完整的E． coli K－12 MG1655基因组，序列准确率达到99．5％。他们利用的流程称为nanocorrect，首先利用graph－ based，greedy partial order aligner方法进行纠错，然后利用Celera Assembler将纠错后的reads进行组装，最后利用nanopolish对组装结果进行进一步提升。

　　4、单核苷酸变异检测工具Reference allele bias是一种在变异检测中倾向于少检测出变异的现象。该现象在测序reads错误率高的情况下尤为严重。MarginAlign中的marginCaller模块是研究机构开发的适用于MinION测序数据的变异检测软件。MarginCaller利用maximum－likelihood参数估计和多条测序reads序列比对来检测单核苷酸变异。当计算机模拟出测序错误为1％时，测序深度在60X，marginCaller检测出的SNV具有97％的准确率和完整度。另外一项研究中，研究者利用GraphMap方法，检测人基因组的杂合变异，可以达到96％的准确率。利用计算机模拟的数据，GraphMap同样可以高准确率，高完整度地检测出结构变异。Nanopolish也可以用来检测变异。它用的是event－level alignment算法。

　　在该方法中，从参考基因组序列开始，依次评估参考基因组序列产生的电信号与测序reads的相似性进而依次修饰参考基因组序列，生成一个consensus read。直到consensus read与测序read产生的电信号足够相似，将consensus read与参考基因组序列比较，得到变异。该方法在埃博拉病毒的研究中有大约80％的准确性。PoreSeq采用与Nanopolish类似的算法。它可以利用更低深度的测序数据获得高准确率和高完整度的SNV检测。在一项研究中，PoreSeq在16X测序深度下获得99％准确率和完整度的SNV检测，与marginAlign相比，它显著降低了测序深度。

　　5、共有序列的测序（consensus sequencing）方法MinION测序数据目前只有92％的准确性。在低深度测序的情况下，不能够满足类似单体型（haplotype phasing）和人样品的SNV检测的要求。文章提到的解决问题的方法是rolling circle amplication，它的原理是将一个片段进行多次扩增，在一个DNA分子上生成多个拷贝，这样最终获得的共有序列测序结果的准确率可以达到97％。

 

　　三、MinION目前的应用领域

　　1、即时检测传染源NGS测序方法可以在医院环境下进行传染源等病菌的检测，而MinION测序方法提供的是一种全新的体验。MinION在测序读长，携带的方便性，检测时长方面具有NGS不可比的优势。文献记载从样品准备到发现致病菌只需要6小时时间，而从样品放置机器到发现致病菌只需要4分钟。文章列举了截至目前用MinION测序仪涉及研究的物种及详细描述了西非爆发埃博拉病毒时，MinION测序方法在病毒检测过程中起到的重要作用。

　　2、非整倍体检测MinION可以在胎儿非整倍体产前检测中发挥重要作用。利用NGS平台，通常需要1－3周时间获得结果。而利用MinION测序方法，文献报道只需要4小时。

　　3、太空应用在太空飞行中，发掘细菌和病毒是很困难的事情。大部分研究是将样品带回地球进行测序鉴定。目前，NASA准备利用MinION测序仪在国际空间站进行病菌的实时测序。

 

　　四、展望

　　1、PromethION为了满足研究人员对高通量测序的需求，ONT公司开发了一个台式纳米孔测序仪—PromethION。PromethION有48个flow cell，可以单独运行也可以并行。每个flow cell包括3，000个通道（channel），每天产生6Tb测序数据。

　　2、测序read准确性目前MinION测序仪的测序准确率在92％左右。对于类似致病菌和可变剪切的发掘，这样的测序准确率可以满足需求。但是对于临床检测，通常read准确率需要达到99．99％。因此，文章提到ONT公司需要在测序相关的化学反应和碱基识别软件方面进行优化。另外，文章提到MinION测序方法存在非随机的测序错误。比如MinION不能很好处理长于6个核苷酸的同聚物的测序，同时缺少碱基修饰检测的内参训练。如果这两个问题能够得到解决，共有序列（consensus）测序的准确率可以达到大于99．99％。

　　3、测序read长度目前MinION测序长度达到150kb。在未来一段时间，可以期许其测序长度可以得到更大提升。

　　4、RNA直接测序逆转录和PCR扩增会导致很多RNA自身信息的丢失，所以目前ONT公司和一些研究机构正在尝试用纳米孔技术进行RNA直接测序。之前的研究已经为此奠定了基础，比如研究表明可以对tRNA进行单通道和固态纳米孔（solid－state nanopore）检测，且纳米孔可以检测DNA和tRNA的碱基修饰。

　　5、单分子蛋白测序目前，质谱（mass spectrometry）是做蛋白组分析较好的技术，但是对于灵敏性，准确性和分辨率，目前的技术都存在局限性。2013年一项研究报道了酶介导的蛋白通过单通道纳米孔。这项研究表明蛋白的序列特征可以被检测。这些发现为蛋白质纳米孔测序奠定了很好的基础。